Działalność reformatorska kastylijskiej karmelitanki, Teresy od Jezusa, zmierzająca do powstania nowej rodziny zakonnej (karmelitanek bosych i karmelitów bosych) niosła ze sobą liczne wyzwania i cierpienia, w których uczestniczył także Jan od Krzyża. Nieporozumienia, konflikt jurysdykcyjny (kto nad kim ma władzę), obawa przed rozłamem w łonie zakonu, przesadna surowość, doprowadziły do osadzenia ojca Jana pod koniec 1577 roku w karcerze klasztoru w Toledo. Dziewięciomiesięczny pobyt w więziennej celi, do sierpnia 1578 roku, kiedy to zbiegł przy nadarzającej się okazji, był pełen cierpień fizycznych, psychicznych i moralnych.

Znamy dokładny wygląd toledańskiego karceru dzięki opisom pozostawionym przez naocznych świadków.

„Była to wnęka w murze, która miała służyć za ubikację przy sali przeznaczonej dla najbardziej dostojnych gości. Nie miała okien, jedynie szparę szeroką na cztery palce, przez którą wchodziło nikłe światło z okna samej sali. Wymiary wynosiły mniej więcej 2,7 x 1,6 metra. Więzienna cela była urządzona przy nader niewielkim nakładzie sił i pieniędzy. Po zlikwidowaniu ubikacji  ustawiono pryczę z dwoma starymi kocami i do kompletu ławę, na której Jan będzie mógł położyć brewiarz, jedyną dozwoloną mu książkę. Co do ubrania musi się zadowolić tym, co ma na sobie; nie dostanie nic innego ani do ochrony przed zimnem, ani do zmiany bielizny. Pozbawiono go zresztą części szat, kaptura i szkaplerza, na znak kary za jego buntowniczą postawę”.

Dieta osadzonego w karcerze Jana składała się z wody, chleba i dwóch, a czasami jednej lub połówki sardynki. Dwa razy w tygodniu obowiązkowy był post o chlebie i wodzie. Aby rozprostować kości mógł wyjść za pozwoleniem brata strażnika na korytarz lub do refektarza. W dniach ścisłego postu jadł swój skromny posiłek, wodę i chleb, klęcząc na środku refektarza na oczach braci siedzących za stołami. Po posiłku obnażał ramiona i plecy, a przechodzący obok bracia chłostali go rózgami. Cierpienia Jana dopełniały zimno w nocy i upał za dnia, a ponadto choroby żołądka i gardła. Przez sześć miesięcy nie otrzymał żadnej bielizny na zmianę, a ta, którą miał na sobie była już w strzępach.

Podczas pobytu Jana w więziennym karcerze pilnowało go dwóch strażników. Pierwszy, którego imienia nie znamy, opiekował się więźniem przez sześć miesięcy. Był człowiekiem nader surowym, nie zgadzał się na żadne ulgi i rygorystycznie stosował się do zakonnych przepisów. Drugi strażnik nosił imię ojciec Jan od Najświętszej Maryi Panny. Przy ojcu Janie spędził kolejne trzy miesiące, a na jego procesie beatyfikacyjnym w 1616 roku zeznawał jako jeden ze świadków. Z charakteru i postepowania był zaprzeczeniem poprzedniego strażnika. Bardziej wrażliwy i wyrozumiały starał się na różny sposób ulżyć więźniowi. Dostarczał świeżą bieliznę, papier do pisania, atrament, pozwalał także na dłuższe przebywanie w przestronnej sali i, jeśli było to możliwe, oszczędzał ojcu Janowi pobytów w refektarzu kończących się chłostaniem rózgami.

Pośród cierpień toledańskiego karceru Jan doświadczał intensywnych łask mistycznych i poetyckiego geniuszu. Właśnie w tym okresie napisał poematy:

• Pieśń duchowa
• Znam dobrze źródło
• romance

Tak jak pragnął, cierpienie upodabniało go do Chrystusa, oczyszczało i otwierało na wiedzę rzeczy duchowych, z której mogą czerpać ludzie kolejnych pokoleń.